การศึกษาจำนวนชุดโครโมโซมโดยใช้เครื่อง Flow cytometry อาศัยหลักการการติดฉลากด้วยสารเรืองแสงที่ดีเอ็นเอ แล้วเครื่องจะดูดนิวเคลียสของพืชเข้าไปในหลอด capillary ทีละอัน จากนั้นเครื่องจะยิงแสงเลเซอร์เข้ามากระตุ้นให้สารเรืองแสงปล่อยพลังงานแสงออกมา แล้วโปรแกรมคอมพิวเตอร์ภายในเครื่องจะประมวลผลปริมาณดีเอ็นเอจากปริมาณแสงที่ถูกปล่อยออกมานั่นเอง ซึ่งวิธีนี้สามารถศึกษาจำนวนชุดโครโมโซมได้ง่ายกว่าวิธีการนับจำนวนโครโมโซมแบบดั้งเดิม

ข้าพเจ้า นางสาวยุพเยาว์ คบพิมาย ตำแหน่งอาจารย์ สังกัด สาขาพันธุศาสตร์ ขอนำเสนอรายงานสรุปเนื้อหาและการนำไปใช้ประโยชน์จากการเข้าร่วมประชุมเรื่อง การศึกษาชุดโครโมโซมในเซลล์พืชด้วยเครื่อง Flow Cytometry “Plant DNA Ploidy Analysis with Flow Cytometry” เมื่อวันที่ 23 กุมภาพันธ์ 2558 เวลา 13.30 -15.00 น. ณ ห้อง PT 307 ชั้น 3 อาคารพืชศาสตร์และเทคโนโลยี ตามหนังสืออนุญาตเดินทางไปราชการเลขที่ ศธ0523.4.9.1/027 ลงวันที่ 17 กุมภาพันธ์ 2558 ซึ่งการประชุมดังกล่าวข้าพเจ้าไม่ใช้งบประมาณของคณะวิทยาศาสตร์และมหาวิทยาลัย ดังนั้นจึงขอนำเสนอสรุปเนื้อหาและการนำไปใช้ประโยชน์ของการประชุมวิชาการดังต่อไปนี้

          ปริมาณดีเอ็นเอในเซลล์พืชมีผลต่อการแสดงลักษณะของพืช ในบางครั้งการมีจำนวนโครโมโซมเพิ่มขึ้น (ทำให้ปริมาณดีเอ็นเอเพิ่มขึ้นด้วย) จะทำให้พืชมีลักษณะเปลี่ยนไป เช่น ขนาดของผลหรือดอกใหญ่ขึ้น เป็นต้น นอกจากนี้ในการในการปรับปรุงพันธุ์พืชเพื่อให้ได้ผลไม้ไร้เมล็ดก็ต้องทำให้พืชนั้นมีจำนวนโครโมโซมเพิ่มขึ้นเป็นเท่าตัวจะได้มีจำนวนชุดโครโมโซมจาก 2 ชุด เปลี่ยนเป็น 4 ชุด เมื่อผสมพืชที่มีจำนวนชุดโครโมโซม 4 ชุด กับพืชปกติที่มีโครโมโซม 2 ชุด จะได้พืชที่มีโครโมโซม 3 ชุด ซึ่งจะเป็นหมันจึงไม่มีเมล็ด    ดังนั้นการเพิ่มจำนวนโครโมโซมในพืชจึงมักถูกนำมาใช้ในการปรับปรุงพันธุ์พืช โดยเฉพาะพืชที่ยังไม่ทราบลำดับเบสทั้งจีโนม

          ในอดีตการตรวจหาจำนวนชุดโครโมโซมในพืชมักใช้วิธีการนับจำนวนโครโมโซมโดยการดูเซลล์ภายใต้กล้องจุลทรรศน์ซึ่งเป็นวิธีที่ใช้เวลานาน เพราะโครโมโซมต้องกระจายตัวไม่ซ้อนทับกันภายในเซลล์จึงจะสามารถนับจำนวนโครโมโซมในเซลล์นั้นๆ ได้ ในปัจจุบันมีการพัฒนาเครื่อง Flow cytometry เพื่อหาจำนวนชุดโครโมโซมซึ่งทำให้สะดวก และประหยัดเวลามากกว่าวิธีเดิม

          การเตรียมตัวอย่างพืชก่อนที่จะนำไปใช้กับเครื่อง Flow cytometry นั้นทำได้ง่าย โดยการสับเซลล์ให้ละเอียดในสารละลายบัฟเฟอร์ แล้วกรองเอาชิ้นส่วนที่มีขนาดใหญ่ออก  และจะได้เฉพาะนิวเคลียสที่อยู่ในสารละลายบัฟเฟอร์ แล้วทำการย้อมดีเอ็นเอด้วยสารเรืองแสง (Fluorescent dye) จากนั้นนำไปเข้าเครื่อง Flow cytometry เครื่องจะดูดนิวเคลียสทีละอันผ่าน capillary เข้าไป จากนั้นจะมีแสงเลเซอร์ยิงเข้ามาเพื่อกระตุ้นให้สารเรืองแสงปล่อยพลังงานแสงออกมา (รูปที่ 1) แล้วจะมีการวิเคราะห์ปริมาณแสงที่ปล่อยออกมานี้โดยโปรแกรมคอมพิวเตอร์ เพื่อประมวลผลปริมาณดีเอ็นเอทั้งหมดที่อยู่ในนิวเคลียสนั้นๆ (หมายเหตุ: ขนาดของcapillary ของเครื่อง Flow cytometry แต่ละรุ่นจะไม่เท่ากัน ก่อนทำการทดลองควรศึกษาขนาดของนิวเคลียสที่ต้องการศึกษาว่าสามารถผ่านเข้าไปใน capillary ได้หรือไม่ ถ้านิวเคลียสใหญ่เกินไปจะไปอุด capillary ทำให้ไม่สามารถใช้งานได้) 

รูปที่ 1 หลักการทำงานของเครื่อง Flow cytometry 

เครื่อง Flow cytometry จะแสดงผลการวัดปริมาณดีเอ็นเอออกมาในแบบรูปกราฟ ซึ่งการแปรผลจะต้องเทียบกับปริมาณดีเอ็นเอมาตรฐาน จึงจะทราบว่ามีจำนวนโครโมโซมกี่ชุด ตัวอย่างการวัดปริมาณดีเอ็นเอในมะเขือที่พบว่า unknown ที่นำมาวัดมีโครโมโซม 2 ชุด (Diploid) แสดงในรูปที่ 2 

รูปที่ 2 ผลการวัดปริมาณดีเอ็นเอในมะเขือ เมื่อเปรียบเทียบกับดีเอ็นเอมาตรฐานแล้วพบว่าดีเอ็นเอมะเขือที่นำมาตรวจสอบนั้นมีปริมาณดีเอ็นเอเท่ากับ Diploid control ดังนั้นมะเขือจึงมีจำนวนโครโมโซม 2 ชุด

การประยุกต์ใช้งานเครื่อง Flow cytometry นั้นทำได้หลากหลาย เช่น การตรวจสอบชนิดของเซลล์ที่ผลิตโปรตีนที่จำเพาะ แต่การศึกษาต้องติดฉลากสารเรืองแสงเข้ากับแอนติเจนที่สามารถไปจับกับโปรตีนที่เซลล์นั้นผลิตออกมาได้ แต่ข้อจำกัดคือเซลล์จะต้องมีการขับโปรตีนออกมานอกเซลล์จึงจะสามารถตรวจสอบได้

          ปัจจุบันเครื่อง Flow cytometry ยังมีราคาแพง ห้องปฏิบัติการบางแห่งยังไม่สามารถซื้อได้ แต่บริษัทบางแห่งได้รับวิเคราะห์ตัวอย่างในราคาไม่แพง ดังนั้นการวิจัยเพื่อสร้างพืชให้มีปริมาณดีเอ็นเอที่ต้องการจึงมีความสะดวก และประหยัดเวลามากยิ่งขึ้น