การเตรียมตัวอย่างมีความสำคัญ เพื่อทำความสะอาดตัวอย่างเพื่อที่จะได้โครมาโทแกรมหรือผลการทดลองที่สามารถแปลผลได้ง่ายขึ้น เพื่อเพิ่มความเข้มข้นของสารตัวอย่างเพื่อที่จะนำไปวิเคราะห์ด้วย GC หรือ HPLC ได้ และเพื่อลดปัญหา downtime ของตัวเครื่องมือ GC หรือ HPLC เช่น ion source ของ LCMS ต้องเตรียมตัวอย่างเพียงพอดีแค่ไหนขึ้นอยู่กับตัวอย่าง หรือ analyte ที่สนใจ ให้มั่นใจที่จะแปลผลและรายงานผลว่าสารที่สนใจมีอยู่จริงและมีอยู่ปริมาณเท่าไหร่ ปัจจัยที่มีผลต่อการเตรียมตัวอย่าง ได้แก่ การเข้าใจตัวอย่างของเราในทาง Physical และ Chemical ต้องทราบว่าสารสำคัญที่สนใจอยู่ในฟอร์มไหน อยู่ในตัวอย่างสดหรือในตัวอย่างแห้ง สมบัติของการละลายของสารที่สนใจ (solubility) ละลายได้ดีใน solvent อะไร เพื่อเลือก solvent ในการสกัดที่เหมาะสมเพื่อให้ได้ปริมาณ Yield ในการสกัดที่มากขึ้น บางสารมีสมบัติสามารถระเหยได้ (Volatility) ถ้าเราเข้าใจในตัวอย่างว่ามีตัว interference เป็นอะไร เราจะเลือกเทคนิคอะไรในการเตรียมตัวอย่าง

ภาพรวมและการเตรียมตัวอย่างสำหรับการวิจัยสมุนไพร

โดยใช้เทคนิคโครมาโทกราฟี และเทคนิคสเปกโทรสโคปี

นางสาวรุ่งทิพย์ กาวารี

นักวิทยาศาสตร์

จากเทรนในการทำวิจัยปัจจุบันมีการใช้สมุนไพรหลากหลายชนิด จะนำมาทำเป็นยารักษาโรค รวมถึง กิน ดื่ม ทา เพราะฉะนั้นต้องมีข้อมูลเพียงพอสำหรับนำไปใช้ ต้องผ่านการทดลองก่อน และที่สำคัญ เพื่อให้ได้ผลการทดลองต้องมีการเตรียมตัวอย่างที่เหมาะสมเพื่อวิเคราะห์ด้วยเทคนิคเกี่ยวกับงานด้านสมุนไพร LC หรือ GC

การเตรียมตัวอย่างสำหรับงานทางด้านสมุนไพร มีเทคนิคที่แนะนำซึ่งเป็นส่วนหนึ่งใน Handbook หมายเลข 599-3326EN Sample preparation Fundamentals for Chromatography ได้แก่ Filtration, Liquid-liquid Extraction, Solid-supported liquid Extraction, Solid Phase Extraction (SPE), Solid Phase Micro Extraction (SPME)

การเตรียมตัวอย่างมีความสำคัญ เพื่อทำความสะอาดตัวอย่างเพื่อที่จะได้โครมาโทแกรมหรือผลการทดลองที่สามารถแปลผลได้ง่ายขึ้น เพื่อเพิ่มความเข้มข้นของสารตัวอย่างเพื่อที่จะนำไปวิเคราะห์ด้วย GC หรือ HPLC ได้ และเพื่อลดปัญหา downtime ของตัวเครื่องมือ GC หรือ HPLC เช่น ion source ของ LCMS ต้องเตรียมตัวอย่างเพียงพอดีแค่ไหนขึ้นอยู่กับตัวอย่าง หรือ analyte ที่สนใจ ให้มั่นใจที่จะแปลผลและรายงานผลว่าสารที่สนใจมีอยู่จริงและมีอยู่ปริมาณเท่าไหร่

ปัจจัยที่มีผลต่อการเตรียมตัวอย่าง ได้แก่ การเข้าใจตัวอย่างของเราในทาง Physical และ Chemical ต้องทราบว่าสารสำคัญที่สนใจอยู่ในฟอร์มไหน อยู่ในตัวอย่างสดหรือในตัวอย่างแห้ง  สมบัติของการละลายของสารที่สนใจ (solubility) ละลายได้ดีใน solvent อะไร เพื่อเลือก solvent ในการสกัดที่เหมาะสมเพื่อให้ได้ปริมาณ Yield ในการสกัดที่มากขึ้น  บางสารมีสมบัติสามารถระเหยได้ (Volatility) ถ้าเราเข้าใจในตัวอย่างว่ามีตัว interference เป็นอะไร เราจะเลือกเทคนิคอะไรในการเตรียมตัวอย่าง

เทคนิคการเตรียมตัวอย่างที่ volatile ได้ มี 2 เทคนิค ได้แก่

1. Headspace เช่น ตัวอย่างเป็นของเหลว เป็นผง ใส่ลงในขวดแล้วปิดฝาให้แน่น แล้วให้ความร้อน ตามเวลา สารที่สนใจที่สามารถระเหยได้ก็จะเป็นไอระเหยขึ้นมาอยู่ในส่วนของ space นำเข็ม gas tight syringe ฉีดเข้า GC ได้เลย ทำให้ช่วยลดปัญหาเรื่อง interference
2. Solid Phase Microextraction (SPME) เป็นเทคนิคที่ต่อยอด Headspace เมื่อทำ Headspace แล้วพบว่าสารที่สนใจมีอยู่เจือจางมาก เอาขวด Headspace ที่ให้ความร้อนแล้วมา นำตัว SPME กดลงไป ด้านในของ SPME จะมี fiber อยู่หลายชนิด กำหนดอุณหภูมิ เวลา ตัว Analytes ที่สนใจก็จะ absorb อยู่บนพื้นผิวของตัว fiber ของตัว SPME หลังจากนั้นก็กด SPME กลับเข้าไป แล้วเอาไปฉีดเข้า GC ได้ เพราะฉะนั้นก็จะได้ส่วนของตัว Analytes ที่ volatile แล้วเข้มข้นมากขึ้น ปัจจุบัน SPME fiber หักง่าย ทำให้มีการจัดทำ SPME Arrow ขึ้นมา เป็นปลายเข็ม ทำให้แข็งแรงขึ้น ทนทานขึ้น นอกจากนี้ยังมีการเคลือบ fiber ยาวขึ้น จาก 1 cm เป็น 2 cm ทำให้มีปริมาณสารที่สนใจมากขึ้น ได้โครมาโทแกรมที่มีสัญญาณเพิ่มขึ้น 5-10 เท่า

เทคนิคการเตรียมตัวอย่าง: เทคนิค Filtration การกรองเป็นการเตรียมตัวอย่างทางกายภาพ เพื่อกรอง particle ที่ไม่ละลายในตัวทำละลายของเราออกไป เช่น ผง ฝุ่น ออกไปเพื่อไม่ให้อุดตันในคอลัมน์ แต่ไม่สามารถกรองสาร A กับ B ออกจากกันได้ ซึ่งการกรองมีหลากหลาย เช่น กระดาษกรอง, พับกระดาษกรองเพื่อเพิ่มพื้นที่ผิวในการกรอง, filter membrane กรอง mobile phase, syringe filter, cartridge filter แล้วแต่การเลือกใช้งาน การเลือก filter membrane มีหลายชนิด เช่น Nylon membrane สามารถกรอง methanol, acetonitrile, น้ำ ได้ดี แต่มีข้อจำกัดคือ ไม่ทนกรด หรือ buffer ที่มี pH ต่ำ ทำให้ Nylon ละลายออกมาไปตันคอลัมน์ PTFE ใช้กรองตัวอย่างน้ำผ่านไม่ได้ แต่ Hydrophilic PTFE สามารถใช้กรองได้ทั้งน้ำและ solvent และทน pH ได้ 1-14 การเลือกขนาดขึ้นอยู่กับปริมาตรของ sample การเลือกขนาด pore size ขึ้นอยู่กับเทคนิคที่เราใช้วิเคราะห์ ถ้าวิเคราะห์ด้วย HPLC อย่างน้อยต้องมีขนาดรูพรุน 0.45 ไมครอน แต่ถ้ามี UHPLC ต้องกรองผ่าน 0.2 ไมครอนเท่านั้น ด้วยเทคนิค UHPLC ระบบ calpillary มี ID ที่เล็กกว่า HPLC รวมถึงคอลัมมี partical ที่เล็กกว่า ดังนั้น ตัวอย่าง และ mobile phase จำเป็นต้องกรองให้ละเอียดกว่าตัว HPLC ปกติ

เทคนิคการเตรียมตัวอย่าง: เทคนิค Liquid-liquid extraction เป็นการแยกสารชั้นน้ำกับชั้น solvent แต่ทำให้เกิดชั้น emulsion ทำให้ต้องสกัดซ้ำหลายรอบ มีทางเลือกที่เรียกว่า ChemElut S มีลักษณะคล้าย SPE ด้านในมีลักษณะคล้ายฟองน้ำ ทำให้พื้นที่ผิวในการสกัดเยอะขึ้น ให้ผล recovery ที่ดีกว่า conventional method

เทคนิคการเตรียมตัวอย่าง: เทคนิค QuEChERS เหมาะสำหรับการวิเคราะห์งาน pesticide และนำมาประยุกต์ในงานสมุนไพรในปัจจุบัน

เทคนิคการเตรียมตัวอย่าง: เทคนิค SPE นิยมใช้กับงานสมุนไพร มี 4 ขั้นตอน ได้แก่ 1) Condition and equilibrium การเตรียม sorbent ให้มันตื่น พร้อมที่จะใช้งาน แล้วก็ทำ equilibrium เหมือน HPLC คอลัมน์ พร้อมที่จะจับกับตัว Analyte 2) การ load sample 3) Wash สิ่งรบกวนออกไป 4) Elute สารที่เราสนใจออกมาเพื่อเอาไปใช้งานต่อ ข้อดีของ SPE คือ หลายองค์ประกอบกรองผ่านออกมาหมด แต่ไม่เฉพาะเจาะจงสาร

โดยสรุป ตัวอย่างต่างกันอาจจะใช้เทคนิคการเตรียมตัวอย่างที่ต่างกัน ควรเลือกเทคนิคให้เหมาะกับสารที่ต้องการวิเคราะห์ เข้าใจสารที่ต้องการวิเคราะห์ช่วยให้ลดเวลาในการเตรียมตัวอย่าง ไม่มีเทคนิคไหนที่เตรียมตัวอย่างได้ดีที่สุด บางครั้ง ต้องใช้หลาย ๆ เทคนิครวมกัน

ที่มา: จากการสรุปเนื้อหาการเข้าร่วมงานสัมมนาออนไลน์ในหัวข้อ “แนวทางการเตรียมตัวอย่างสำหรับการวิจัยสมุนไพร” โดยใช้เทคนิค โครมาโทกราฟีเพื่อตรวจสอบสารปนเปื้อน รวมถึงการใช้เทคนิคสเปกโทรสโคปีเพื่อตรวจสอบสารโลหะหนัก เมื่อวันที่ 14 มกราคม 2564 ออนไลน์ผ่านระบบ WEBCAST โดย คุณวิมุติ เสริมศรี