เทคโนโลยีการแก้ไขจีโนม (genome editing) เป็นเทคนิคใหม่ที่นำมาใช้ในการแก้ไขยีนเป้าหมาย ทำให้เกิดการเปลี่ยนแปลงจีโนมได้อย่างแม่นยำ โดยใช้เอนไซม์นิวคลีเอสที่ได้ผ่านการดัดแปลงพันธุกรรม ทำให้เกิดการเติม ตัด และเปลี่ยนลำดับเบสของยีนที่ต้องการในจีโนม เทคโนโลยีการแก้ไขจีโนมที่เป็นที่นิยมคือ ระบบ CRISPR/Cas9 ได้ถูกนำมาใช้ในการปรับปรุงพันธุ์พืชเศรษฐกิจหลายชนิดทำให้พืชมีลักษณะที่ดีทางการเกษตร และการปรับปรุงพันธุ์พืชทำได้รวดเร็ว ถูกต้อง แม่นยำ และมีประสิทธิภาพ

บทนำเกี่ยวกับเทคโนโลยีการแก้ไขจีโนม

          เทคโนโลยีการแก้ไขจีโนม (Genome editing) คือ การเปลี่ยนแปลงดีเอ็นเอของสิ่งมีชีวิตที่ตำแหน่งเฉพาะในจีโนม โดยทำได้หลายวิธี เช่น ZFNs, TALENS และ CRISPR/Cas9 ในปัจจุบันวิธี CRISPR/Cas9 เป็นที่นิยมเนื่องจากทำได้รวดเร็ว ราคาถูก มีความถูกต้อง และมีประสิทธิภาพมากกว่าวิธีแก้ไขจีโนมแบบอื่น เทคนิค CRISPR/Cas9 ย่อมาจาก CRISPR คือ clustered regularly interspersed short palindromic repeats และ Cas9 คือ CRISPR-associated protein 9

          CRISPR/Cas9 พัฒนามาจากระบบการแก้ไขจีโนมของแบคทีเรียในธรรมชาติ CRISPR เป็นลำดับเบสของดีเอ็นเอที่อยู่ในจีโนมของแบคทีเรีย อยู่เรียงต่อกันเป็นแถว (CRISPR arrays) ซึ่งจะทำให้แบคทีเรียสามารถจดจำไวรัสได้ เมื่อไวรัสบุกรุก แบคทีเรียจะสร้างชิ้นส่วนอาร์เอ็นเอมาจาก CRISPR arrays เพื่อไปจับกับดีเอ็นเอของไวรัสเป้าหมาย แล้วแบคทีเรียมีโปรตีน Cas9 ซึ่งเป็นเอนไซม์นิวคลีเอสทำหน้าที่ตัดดีเอ็นเอของไวรัส ทำให้ไวรัสไม่สามารถแพร่กระจายได้

          การนำ CRISPR/Cas9 มาประยุกต์ใช้โดยการสร้างอาร์เอ็นเอสายสั้น ๆ ที่มีลำดับเบสทำหน้าที่เป็นไกด์ (short guide RNA) ซึ่งจะไปจับกับลำดับเบสของดีเอ็นเอเป้าหมายในจีโนม และอาร์เอ็นเอยังสามารถจับกับเอนไซม์ Cas9 ได้อีกด้วย หลักการทำงานคล้ายกับระบบของแบคทีเรียในธรรมชาติโดย RNA ที่ได้รับการดัดแปลงนี้จะทำหน้าที่จดจำลำดับเบสของดีเอ็นเอ ส่วน Cas9 ทำหน้าที่เป็นเอนไซม์ตัดดีเอ็นเอเป้าหมาย นอกจากเอนไซม์ Cas 9 ที่นิยมใช้มากที่สุดแล้ว ยังมีเอนไซม์ชนิดอื่น ๆ อีก เช่น Cpf1 เป็นต้น หลังจากที่ดีเอ็นเอถูกตัดแล้ว ระบบซ่อมแซมดีเอ็นเอภายในเซลล์จะทำการเพิ่มหรือลดเบส หรือเปลี่ยนแปลงดีเอ็นเอโดยการแทนที่ชิ้นดีเอ็นเอที่มีอยู่แล้วด้วยชิ้นที่มีลำดับเบสใหม่

          องค์ประกอบหลักของ CRISPR/Cas9 คือ guide RNA, Cas9, ยีนเป้าหมาย (target gene), ลำดับเบสเฉพาะ (PAM) ของตำแหน่งดีเอ็นเอเป้าหมาย การขนส่งระบบการแก้ไขยีนเข้าสู่เซลล์ (delivery methods) รูปแบบการแก้ไขยีนที่ต้องการหลังจากการตัด มีพืชหลายชนิดที่มีการแก้ไขจีโนมโดยเทคนิค CRISPR/Cas9 ได้แก่ แอปเปิ้ล ส้ม มะละกอ แตงโม มะเขือเทศ

เทคโนโลยีการแก้ไขจีโนมในการพัฒนาพันธุ์พืช 

องค์ประกอบของเทคนิคการแก้ไขจีโนมในพืช ได้แก่ ชนิดของพืชและยีนเป้าหมาย การทราบลำดับเบสของจีโนม ศักยภาพของเซลล์พืชในการเกิด somatic embryogenesis เพื่อทำให้เกิดพัฒนาเป็นต้นสมบูรณ์ ระบบการถ่ายยีนเข้าสู่เซลล์พืช ระบบเวกเตอร์ที่เหมาะสมในการใช้เป็น Toolbox ของการแก้ไขจีโนมในยีนเป้าหมาย และวิธีการวิเคราะห์และประเมินพืชที่ได้รับการแก้ไขจีโนม (edited plants) ที่มีประสิทธิภาพ

การขนส่งระบบการแก้ไขจีโนมเข้าสู่เซลล์พืช แบ่งออกเป็น 3 วิธี คือ

1. วิธีใช้ดีเอ็นเอ (DNA-based) ทำได้โดยวิธีการถ่ายยีนโดยอะโกรแบคทีเรียม (Agrobacterium-mediated transformation) การใช้เครื่องยิงอนุภาค  (particle bombardment) และการใช้ไวรัส (viral infection) ทำโดยการถ่ายดีเอ็นเอของยีน Cas9 และ single guide RNA (sgRNA) โดยมีระบบของ Cas9 expression system เพื่อให้ยีนไปแสดงออกในเซลล์พืช วิธีนี้สามารถใช้ถ่ายยีนเข้าสู่เนื้อเยื่อของพืชได้
2. วิธีใช้อาร์เอ็นเอ (RNA-based) ทำได้โดยการถ่ายอาร์เอ็นเอโดยตรง (Direct transfection) โดยการถ่ายอาร์เอ็นเอเข้าสู่โปรโตพลาสต์ (protoplast transformation) โดยการถ่าย Cas9-mRNA และ synthetic sgRNA เข้าสู่เซลล์พืช แคลลัส หรือโปรโตพลาสต์
3. วิธีใช้โปรตีน (Protein-based) หรือวิธีใช้ไรโบนิวคลีโอโปรตีน  (Ribonucleoprotein [RNP] transfection) ทำได้โดยการถ่ายโปรตีนโดยตรง (Direct transfection) โดยการถ่ายโปรตีนเข้าสู่โปรโตพลาสต์ การใช้เครื่องยิงอนุภาค การใช้กระแสไฟฟ้า (electroporation) โดยการถ่ายโปรตีน Cas9 ที่แยกบริสุทธิ์ ร่วมกับ synthetic sgRNA เข้าสู่เซลล์พืช แคลลัส หรือโปรโตพลาสต์

          ตัวอย่างของพืชที่ได้รับการแก้ไขจีโนมและมีลักษณะที่ดีทางการค้า เช่น แอปเปิ้ลที่ไม่เกิดสีน้ำตาล (non-browning) คาร์เนชันที่ต้านทานสารปราบวัชพืช ชิโครีที่ต้านทานสารปราบวัชพืชและมีระบบควบคุมการผสมเกสร กุหลาบที่มีคุณภาพดี สควอชต้านทานโรค พริกต้านทานโรค มะเขือเทศต้านทานโรคและแมลง แตงกวาต้านทานไวรัส นอกจากนี้ยังมี

-        การขนส่งระบบการแก้ไขจีโนมโดยวิธีไรโบนิวคลีโอโปรตีน (RNPs) โดยการถ่ายโอน RNPs โดยตรงเข้าสู่เซลล์ขององุ่นและแอปเปิ้ล

-        การแก้ไขจีโนมในข้าว เช่น การพัฒนาให้ข้าวมีเกสรตัวผู้เป็นหมันที่ตอบสนองต่ออุณหภูมิ (thermo-sensitive genic male sterile; TGMS) เพื่อเป็นประโยชน์ต่อการสร้างข้าวลูกผสม (hybrid rice)

-        การแก้ไขจีโนมมันสำปะหลังทำให้ไม่สร้างสารไซยาไนด์ cyanide-free cassava

-        การแก้ไขจีโนมข้าวโพดโดยวิธี RNPs ทำให้เกสรเพศผู้เป็นหมัน โดยการเกิด biallelic mutation

          การพัฒนาพันธุ์พืชด้วยเทคนิคการแก้ไขจีโนมจะประสบความสำเร็จจำเป็นต้องมีข้อมูลจีโนมของพืชที่สมบูรณ์และถูกต้อง ข้อมูลด้านพันธุศาสตร์โมเลกุลของพืช ข้อมูลของยีนเป้าหมายและทราบหน้าที่ของยีน และมีระบบการเพาะเลี้ยงเนื้อเยื่อและการพัฒนาเป็นต้นของพืชที่ดี

          ดังนั้น เทคโนโลยีการแก้ไขจีโนมสามารถนำมาใช้เป็นเครื่องมือในการปรับปรุงพันธุ์พืช โดยช่วยร่นระยะเวลา ทำให้มีการแก้ไขยีนเป้าหมายได้อย่างแม่นยำ และมีประสิทธิภาพ โดยมีปัจจัยสำคัญที่ทำให้เทคโนโลยีการแก้ไขจีโนมประสบความสำเร็จ คือ ระบบการเพาะเลี้ยงเนื้อเยื่อพืชและการพัฒนาเป็นต้นได้ ระบบการถ่ายยีนเข้าสู่เซลล์พืชที่มีประสิทธิภาพ และข้อมูลลำดับเบสของจีโนมพืชที่สมบูรณ์

เอกสารอ้างอิง 

เอกสาร powerpoints ประกอบการบรรยายในโครงการ Frontiers in AgTech Seminar Series Part 3 “Genome Editing in Agriculture” เมื่อวันที่ 8 สิงหาคม 2562 ณ ศูนย์การศึกษาและฝึกอบรมนานาชาติ มหาวิทยาลัยแม่โจ้ จังหวัดเชียงใหม่

โดย อ.ดร. ทิพปภา พิสิษฐ์กุล อ.ดร. ยี่โถ ทัพภะทัต และผศ.ดร. ศุภชัย วุฒิพงศ์ชัยกิจ