ข้าพเจ้า นางสาวช่อทิพา สกูลสิงหาโรจน์ ตำแหน่ง ผู้ช่วยศาสตราจารย์ สังกัด หลักสูตรพันธุศาสตร์ คณะวิทยาศาสตร์ ขอนำเสนอรายงานสรุปเนื้อหาและการนำไปใช้ประโยชน์จากการเข้าร่วมโครงการบรรยายพิเศษ เรื่อง การพัฒนาเครื่องหมายโมเลกุล เมื่อวันที่ 8 มีนาคม 2560 ณ ห้อง 1108 อาคารเสาวรัจ นิตยวรรธนะ คณะวิทยาศาสตร์ มหาวิทยาลัยแม่โจ้ ตามหนังสือขออนุญาตเข้าร่วมโครงการ เลขที่ ศธ 0523.4.9.1/54 ลงวันที่ 6 เดือน มีนาคม พ.ศ. 2560 ดังนั้น จึงขอนำเสนอสรุปเนื้อหาและการนำไปใช้ประโยชน์ของการเข้าร่วมโครงการ ดังต่อไปนี้
เครื่องหมายดีเอ็นเอ (DNA marker) คือ ชิ้นส่วนดีเอ็นเอสายสั้น ๆ ที่มีลำดับเบสสามารถเข้าคู่กับช่วงใดช่วงหนึ่งบนสายดีเอ็นเอ ทำให้ระบุตำแหน่งบนโครโมโซมและสามารถแยกความแตกต่างของสิ่งมีชีวิตเป้าหมายได้ มีประโยชน์หลายอย่าง ได้แก่ gene mapping, map-based cloning, marker-assisted breeding, plant variety protection, genetic diversity และ purity testing เครื่องหมายดีเอ็นเอที่ดีจะต้องมีคุณสมบัติ คือ เป็น polymorphic มีการถ่ายทอดแบบ co-dominant เกิดทั่วจีโนม ตรวจสอบได้ง่าย รวดเร็ว และราคาไม่แพง ให้ผลที่ทำซ้ำได้ ตรวจสอบจีโนไทป์ได้ครั้งละหลาย ๆ ตัวอย่าง (high-throughput genotyping) ได้ผลถูกต้องและสม่ำเสมอ เครื่องหมายดีเอ็นเอมีหลายชนิด เช่น restriction fragment length polymorphism (RFLP), amplified fragment length polymorphism (AFLP), random amplified polymorphic DNA (RAPD), simple sequence repeat (SSR) และ single nucleotide polymorphism (SNP)
SNPs คือ ความแตกต่างทางพันธุกรรมที่เกิดจากการเปลี่ยนแปลงลำดับเบสบนสายโพลีนิวคลีโอไทด์เพียงตำแหน่งเดียว SNPs มีตำแหน่งอยู่ในจีโนมที่นิวคลีโอไทด์หนึ่งตัวเกิดความแตกต่างในสิ่งมีชีวิตแต่ละตัว เป็นชนิดที่พบมากที่สุดในความหลากหลายทางพันธุกรรมในประชากร เครื่องหมายดีเอ็นเอชนิด SNP (SNP markers) มีราคาถูก ประหยัดเวลา ต้องมีการออกแบบไพรเมอร์อย่างจำเพาะสูง และมีการนำมาประยุกต์ใช้หลายด้าน ได้แก่ ทางการแพทย์ (วิเคราะห์ยีนที่เกี่ยวข้องกับโรค การออกแบบยา และการศึกษาจีโนมมนุษย์) ทางสัตว์ (การวินิจฉัยโรค การระบุสายพันธุ์ และการศึกษาความหลากหลาย) และทางพืช (การจำแนกสายพันธุ์ [variety identification], MAS-breeding, True-to-type analysis, disease identification และ purity testing เป็นต้น
บริษัท East-West seed ก่อตั้งขึ้นในประเทศไทยเมื่อปี ค.ศ. 1983 โดยการผสมผสานเทคโนโลยีเมล็ดพันธุ์จากยุโรป และการทำสวนผักเขตร้อนแบบเอเชียเข้าด้วยกัน ได้สร้างนวัตกรรมการตรวจจีโนไทป์โดยใช้เครื่องหมายดีเอ็นเอแบบ SNPs คือ High-throughput SNP genotyping นำมาตรวจสอบในขั้นตอนต่าง ๆ ของการผลิตเมล็ดพันธุ์และการปรับปรุงพันธุ์พืช ได้แก่ ใน breeding program มีการตรวจสอบ plant selection (inbred lines) ใน purity testing มีการตรวจสอบ homogeneity testing และ hybridity testing
บริษัทได้นำระบบ high-throughput SNP genotyping system ซึ่งเป็นระบบที่มีการใช้เครื่องมืออัตโนมัติที่ทันสมัยมาใช้ตรวจสอบตัวอย่างได้ครั้งละหลาย ๆ ตัวอย่างพร้อม ๆ กัน ประกอบด้วยขั้นตอนต่าง ๆ คือ High-throughput DNA extraction คือ การสกัดตัวอย่างจากใบและเมล็ดได้ครั้งละ 120,000 ตัวอย่าง, High-throughput PCR preparation คือ การเตรียมตัวอย่างของปฏิกิริยา PCR ได้ครั้งละ 80,000 ตัวอย่าง/one roll/array tape, High-throughput PCR machine (เครื่อง Soellex) ทำปฏิกิริยา PCR ได้ครั้งละ 240,000 ตัวอย่าง และการวิเคราะห์ PCR products โดยใช้เครื่อง fluorescence scanning machine (เครื่อง Araya) โดยวิเคราะห์ตำแหน่ง SNPs ได้ภายในเวลา 20-30 วินาที
การพัฒนา SNP markers มีกระบวนการดังนี้ คือ ออกแบบ SNP markers โดยอาศัยข้อมูลจากฐานข้อมูลจีโนม คัดเลือก SNP markers โดยการตรวจคัดกรองจากทุกสายพันธุ์ของพืชแต่ละชนิด คัดเลือก SNP markers ที่ให้ผล polymorphism เมื่อทดสอบกับพันธุ์พ่อ แม่ และลูกผสม สร้างลายพิมพ์ดีเอ็นเอ (DNA fingerprints โดยใช้ชุดที่ประกอบด้วย 72 SNP markers คัดเลือก 4 SNP markers สำหรับ hybridity testing และ 12 SNP markers สำหรับ homogeneity testing และตรวจสอบ (validation) polymorphic markers ที่คัดเลือกไว้กับตัวอย่างจำนวนมาก โดยพืชที่นำมาตรวจสอบเป็นประจำ ได้แก่ มะเขือเทศ พริก แตงกวา แตงโม หัวหอม มะละกอ ข้าวโพด และเมล่อน
การนำเทคโนโลยี High-throughput SNP genotyping system มาใช้ในการตรวจสอบคุณภาพ (quality assurance; QA) ในขั้นตอนต่าง ๆ ได้แก่ Homogeneity testing (การตรวจสอบสายพันธุ์พ่อแม่), Hybridity testing (การตรวจสอบสายพันธุ์ลูก F1) และ Protocol development (การพัฒนาวิธีการตรวจสอบสายพันธุ์ใหม่ [new varieties]) มีข้อดีกว่าวิธีอื่น ๆ คือ ทำให้การปรับปรุงพันธุ์ทำได้รวดเร็วขึ้น มีความถูกต้องและแม่นยำในการคัดเลือกพืช (inbred lines) ทำให้ออกผลผลิตใหม่ที่มีลักษณะที่ต้องการสู่ตลาดได้เร็วขึ้น ได้ลูกผสม F1 ที่มีพันธุกรรมบริสุทธิ์โดยการตรวจสอบคุณภาพแบบ true-to-type quality ราคาถูก ทำได้รวดเร็ว และมีประสิทธิภาพ และระบบอัตโนมัติแบบ high-throughput ยังให้ข้อมูลที่มีความถูกต้องและแม่นยำสูงอีกด้วย
ในการเข้าร่วมโครงการครั้งนี้ทำให้ได้รับความรู้เกี่ยวกับเครื่องหมายดีเอ็นเอ การใช้เทคโนโลยีที่ทันสมัยโดยอาศัยพื้นฐานของเทคนิคพีซีอาร์ และการประยุกต์ใช้เครื่องหมายดีเอ็นเอชนิด SNPs ในการตรวจสอบและปรับปรุงพันธุ์พืช ซึ่งจะเป็นประโยชน์ต่อการนำมาพัฒนาการเรียนการสอน และการทำงานวิจัยต่อไป