PCR (Polymerase chain reaction) เป็นเทคนิคที่มีการเพิ่มจำนวนสารพันธุกรรม หรือ ดีเอ็นเอของสิ่งมีชีวิต จากปริมาณ DNA ตั้งต้น เพิ่มขึ้นเป็นล้านล้านสำเนา ภายในระยะเวลาอันสั้น ขั้นตอนในการทำ PCR แบบดั้งเดิม ได้แก่ การทำให้ DNA เสียสภาพที่อุณหภูมิสูงและแยกตัวออกเป็นสายเดี่ยว (Denatulation) การจับกันของไพรเมอร์และดีเอ็นเอ โดยการลดอุณหภูมิลง ไพรเมอร์จะเข้าไปจับกับดีเอ็นเอแม่พิมพ์ (Annealing) และการสังเคราะห์ดีเอ็นเอ โดย Taq DNA polymerase จะนำเบสต่างๆ (A, T, C, G) ไปสังเคราะห์ต่อจากไพรเมอร์จนได้ดีเอ็นเอสายคู่เหมือนเดิม (Extension) Quantitative PCR (QPCR) หรือ PCR เชิงปริมาณ เหมาะสำหรับใช้ในหาปริมาณ DNA และสามารถตรวจสอบการขยายตัวของโมเลกุล DNA ได้ในระหว่างการทำ PCR ในเวลาจริง เป็นเทคนิคที่ถูกพัฒนามาจากการทำ PCR แบบดั้งเดิม โดยใช้การติดฉลากด้วยสารเรืองแสงประเภท fluorochrome ทำให้สามารถวัดปริมาณของดีเอ็นเอเป้าหมายตั้งต้นจากสิ่งต้องการตรวจวัดได้และสามารถวัดปริมาณดีเอ็นเอที่เพิ่มขึ้นมาได้ทันที โดยไม่จำเป็นต้องรอให้กระบวนการเสร็จสิ้นก่อน

PCR (Polymerase chain reaction) เป็นเทคนิคที่มีการเพิ่มจำนวนสารพันธุกรรม หรือ ดีเอ็นเอของสิ่งมีชีวิต จากปริมาณ DNA ตั้งต้น เพิ่มขึ้นเป็นล้านล้านสำเนา ภายในระยะเวลาอันสั้น ขั้นตอนในการทำ PCR แบบดั้งเดิม ได้แก่ การทำให้ DNA เสียสภาพที่อุณหภูมิสูงและแยกตัวออกเป็นสายเดี่ยว (Denatulation) การจับกันของไพรเมอร์และดีเอ็นเอ โดยการลดอุณหภูมิลง ไพรเมอร์จะเข้าไปจับกับดีเอ็นเอแม่พิมพ์ (Annealing) และการสังเคราะห์ดีเอ็นเอ โดย Taq DNA polymerase จะนำเบสต่างๆ (A, T, C, G) ไปสังเคราะห์ต่อจากไพรเมอร์จนได้ดีเอ็นเอสายคู่เหมือนเดิม (Extension) Quantitative PCR (QPCR) หรือ PCR เชิงปริมาณ เหมาะสำหรับใช้ในหาปริมาณ DNA และสามารถตรวจสอบการขยายตัวของโมเลกุล DNA ได้ในระหว่างการทำ PCR ในเวลาจริง เป็นเทคนิคที่ถูกพัฒนามาจากการทำ PCR แบบดั้งเดิม โดยใช้การติดฉลากด้วยสารเรืองแสงประเภท fluorochrome ทำให้สามารถวัดปริมาณของดีเอ็นเอเป้าหมายตั้งต้นจากสิ่งต้องการตรวจวัดได้และสามารถวัดปริมาณดีเอ็นเอที่เพิ่มขึ้นมาได้ทันที โดยไม่จำเป็นต้องรอให้กระบวนการเสร็จสิ้นก่อน วิธีการตรวจสอบปริมาณของดีเอ็นเอ 1. ใช้สีฟลูออเรสเซนต์ที่สามารถแทรกจับกับเส้นดีเอ็นเอ ได้แก่ SYBR-Green ซึ่งเป็นสีฟลูออเรสเซนต์ที่สามารถเข้าจับกับดีเอ็นเอตรงตำแหน่ง minor groove ของดีเอ็นเอสายคู่ได้ เมื่อสารนี้ถูกกระตุ้นด้วยแสงอัตราไวโอเลต จะมีการคายพลังงานออกมาเป็นแสงของฟลูออเรสเซนต์ โมเลกุลของสีจะจับได้มากน้อยขึ้นกับความยาวของ PCR product 2. ใช้ probe ที่ติดฉลากด้วยสีฟลูออเรสเซนต์ซึ่งเป็นสารเรืองแสง ในการตรวจสอบ วิธีมีความจำเพาะสูงกว่าการใช้สี SYBR Green โดยการนำ fluorchrome หรือสีฟลูออเรสเซนต์ 2 ประเภท ติดฉลากเข้ากับสาย probe เมื่อ probe ถูกกระตุ้นด้วยแสงพลังงานสูง fluorochrome ตัวแรก (Quencher) จะดูดพลังงานเอาไว้ และถ่ายทอดพลังงานให้ fluorochrome ตัวที่สอง (reporter dye) โดยไม่สูญเสียพลังงานออกมาสู่ระบบภายนอกในรูปของแสง การติดฉลากด้วยฟลูออเรสเซนต์และนำมาใช้ในการไฮบริไดเซซันมี 3 แบบคือ TaqMan hybridization probes, Molecular beacon probes, Scorpion probes 3. ใช้ hybridization probe เป็น probe ที่อาศัยการถ่ายเทพลังงานจากสีฟลูออเรสเซนต์ไปยังอีกสิ่งหนึ่ง โดยมีโอลิโกนิวคลีโอไทด์ ที่มีลำดับเบสจำเพาะ 2 สาย ติดฉลากด้วยสีฟลูออเรสเซนต์ เส้นแรกเป็น upstream probe ซึ่งเป็นโมเลกุลผู้ให้ทางปลาย 3’ ส่วนอีกเส้นเป็น downstream probe ซึ่งเป็นโมเลกุลผู้รับ ทางปลาย 5’ probes ทั้งสองเส้น มีการออกแบบให้ไฮบริไดซ์ที่บริเวณใกล้กันบนโมเลกุลดีเอ็นเอเป้าหมาย ซึ่งทำให้ฟลูออเรสเซนต์ที่ติดอยู่บนโมเลกุลของ probes ทั้งสองเส้น เข้ามาใกล้กันและเกิดการถ่ายเทพลังงาน ทำให้สามารถตรวจสอบแสงฟลูเรสเซนต์ได้ การแปลผลการทดสอบ 1. ผล qPCR จะแสดงในรูปของกราฟ (Amplification plot) โดย แกน x แสดงจำนวนรอบของ PCR แกน Y แสดง Fluorescence intensity 2. Amplification plot แบ่งเป็น 3 ช่วง (Phase) ได้แก่ Initial phase ช่วงที่แสง fluorescence ต่ำ กว่าที่เครื่องจะตรวจวัดได้ Exponential phase เป็นช่วงที่ fluorescence เพิ่มขึ้นแบบ exponential และ Plateau phase เป็นช่วงที่ fluorescence เริ่มคงที่ 3. Threshold หมายถึงเส้นตรงที่ลากขนานกับแกนจำนวนรอบของการทำงานของ real time PCR บน กราฟของ real time PCR ซึ่งเป็นเส้นที่อยู่เหนือเส้น baseline 4. Ct (cycle threshold) values หมายถึง ค่าจำนวนรอบของการทำงานของ real time PCR ที่ให้ค่า แสงฟลูออเรสเซ็นต์ตัดกับเส้น Threshold เป็นค่าที่บ่งชี้ความเข้มข้นของดีเอ็นเอเป้าหมายที่ต้องการทดสอบ