การประยุกต์ใช้เทคนิค Loop-mediated isothermal amplification (LAMP) ในงานวิจัย
วันที่เขียน 27/9/2565 15:43:55     แก้ไขล่าสุดเมื่อ 29/11/2565 22:10:42
เปิดอ่าน: 397 ครั้ง

ปัจจุบันเทคนิคทางอณูพันธุศาสตร์ได้เข้ามามีบทบาทในการทำประโยชน์กับงานหลายๆ ด้าน อาทิเช่น ด้านการแพทย์เพื่อการวินิจฉัยโรค ด้านอุตสาหกรรม สิ่งแวดล้อม และการปรับปรุงพันธุ์พืช การนำเทคนิคทางอณูพันธุศาสตร์เข้ามาช่วยเพิ่มปริมาณสารพันธุกรรม เริ่มจากการใช้เทคนิค Polymerase Chain Reaction เพิ่มชิ้นส่วนดีเอ็นเอเฉพาะส่วนที่ต้องการ ภายในระยะเวลาอันสั้นในหลอดทดลอง ซึ่งจะใช้เวลานานประมาณ 3-4 ชั่วโมง และมีความจำเป็นต้องใช้เครื่อง PCR ในการทำ ซึ่งไม่เหมาะกับห้องปฏิบัติการขนาดเล็ก หรือการทำงานภาคสนาม ดังนั้นจากข้อจำกัดดังกล่าวจึงได้มีการพัฒนาวิธีเพิ่มขยายยีนด้วยเทคนิค Loop-mediated isothermal amplification (LAMP) ขึ้นมา วิธีการนี้สามารถเพิ่มปริมาณสารพันธุกรรมของสิ่งมีชีวิตได้ถึง 109 เท่า ภายในระยะเวลาประมาณ 1 ชั่วโมง การเพิ่มปริมาณ DNA จะใช้อุณหภูมิคงที่เพียงอุณหภูมิเดียว (60-65 ํC) โดยไม่จำเป็นต้องใช้เครื่อง PCR และการ run gel electrophoresis มีการใช้ primers 4 ชุด หรือ 6 ชุด ที่จำเพาะต่อกับสาย DNA แม่พิมพ์ 6 ตำแหน่ง จึงทำให้มีความจำเพาะต่อการตรวจสอบสูง และทำการเพิ่มปริมาณ DNA โดยใช้เอนไซม์ Bst DNA polymerase สำหรับการตรวจสอบยีนที่เพิ่มขยายได้ ในเทคนิค LAMP จะเกิดสาร pyrophosphate เป็น by product ในปฏิกิริยา สารดังกล่าวสามารถจับกับ magnesium กลายเป็น magnesium pyrophosphate ซึ่งจะเกิด ตะกอนสีขาวขุ่น ไม่ละลายน้ำ สามารถมองเห็นได้ด้วยตาเปล่า หรืออาจยืนยันผลด้วยเครื่อง spectrophotometry หรือสารฟลูออเรสเซ็นต์ ซึ่งจะมีปริมาณมากหรือน้อยขึ้นกับปริมาณการเพิ่มขยายยีนนั้นๆ

ปัจจุบันเทคนิคทางอณูพันธุศาสตร์ได้เข้ามามีบทบาทในการทำประโยชน์กับงานหลายๆ ด้าน อาทิเช่น ด้านการแพทย์เพื่อการวินิจฉัยโรค ด้านอุตสาหกรรม สิ่งแวดล้อม และการปรับปรุงพันธุ์พืช การนำเทคนิคทางอณูพันธุศาสตร์เข้ามาช่วยเพิ่มปริมาณสารพันธุกรรม เริ่มจากการใช้เทคนิค Polymerase Chain Reaction เพิ่มชิ้นส่วนดีเอ็นเอเฉพาะส่วนที่ต้องการ ภายในระยะเวลาอันสั้นในหลอดทดลอง เช่น PCR- sequence-specific primers (PCR-SSP), PCR-sequence specific oligonucleotide probes (PCR-SSO), reverse transcription PCR (RT-PCR), nested PCR, multiplex PCR, real-time PCR และ sequence base typing การทำ PCR จะใช้เวลานานประมาณ 3-4 ชั่วโมง และมีความจำเป็นต้องใช้เครื่อง PCR ในการทำ ซึ่งไม่เหมาะกับห้องปฏิบัติการขนาดเล็ก หรือการทำงานภาคสนาม ดังนั้นจากข้อจำกัดดังกล่าวจึงได้มีการพัฒนาวิธีเพิ่มขยายยีนด้วยเทคนิค Loop-mediated isothermal amplification (LAMP) ขึ้นมา วิธีการนี้สามารถเพิ่มปริมาณสารพันธุกรรมของสิ่งมีชีวิตได้ถึง 109 เท่า ภายในระยะเวลาประมาณ 1 ชั่วโมง การเพิ่มปริมาณ DNA จะใช้อุณหภูมิคงที่เพียงอุณหภูมิเดียว (60-65 ํC) โดยไม่จำเป็นต้องใช้เครื่อง PCR และการ run gel electrophoresis มีการใช้ primers 4 ชุด หรือ 6 ชุด ที่จำเพาะต่อกับสาย DNA แม่พิมพ์ 6 ตำแหน่ง จึงทำให้มีความจำเพาะต่อการตรวจสอบสูง และทำการเพิ่มปริมาณ DNA โดยใช้เอนไซม์ Bst DNA polymerase สำหรับการตรวจสอบยีนที่เพิ่มขยายได้ ในเทคนิค LAMP จะเกิดสาร pyrophosphate เป็น by product ในปฏิกิริยา สารดังกล่าวสามารถจับกับ magnesium กลายเป็น magnesium pyrophosphate ซึ่งจะเกิด ตะกอนสีขาวขุ่น ไม่ละลายน้ำ สามารถมองเห็นได้ด้วยตาเปล่า หรืออาจยืนยันผลด้วยเครื่อง spectrophotometry หรือสารฟลูออเรสเซ็นต์ ซึ่งจะมีปริมาณมากหรือน้อยขึ้นกับปริมาณการเพิ่มขยายยีนนั้นๆ

 

กลไกการทำงานของ Loop-mediated isothermal amplification (LAMP)

การเตรียมปฏิกิริยาของเทคนิค LAMP มีส่วนประกอบ ดังนี้

  1. น้ำ
  2. 10X buffer
  3. Betaine
  4. dNTPs
  5. primer mix
  6. Bst. DNA polymerase
  7. ดีเอ็นเอแม่พิมพ์ (template DNA)

 

Bst. DNA polymerase เป็นดีเอ็นเอพอลิเมอเรสชนิดหนึ่งซึ่งได้มาจากแบคทีเรียที่ชื่อว่า Bacillus stearothermophilus ทำงานได้ดีในช่วงอุณหภูมิ 60-65 องศาเซลเซียส จึงเหมาะกับปฏิกิริยาของเทคนิคแลมป์ที่ใช้อุณหภูมิเดียว และมีคุณสมบัติา stand displacement ซึ่งแยกดีเอ็นเอสายคู่ให้เป็นดีเอ็นเอสายเดี่ยวโดยไม่ต้องอาศัยขั้นตอนการเพิ่มอุณหภูมิเพื่อแยกสายดีเอ็นเอแม่แบบ โดยหน้าที่ของ Bst. DNA polymerase นั้นใช้เป็นตัวขับเคลื่อนการสังเคราะห์ดีเอ็นเอสายใหม่ การใช้เทคนิค LAMP จึงมีความยุ่งยากน้อยกว่าเพราะเพียงแค่ใช้เครื่องอบหรือตู้บ่มที่สามารถควบคุมอุณหภูมิได้ก็เพียงพอต่อการทำงานแล้ว แต่เทคนิค LAMP อาจมีความยุ่งยากในการใช้ primer มากกว่า PCR ปกติ โดยใช้ primer 4-6 สาย ที่จำเพาะกับตำแหน่งจดจำบนยีนที่สนใจทำให้เทคนิค LAMP มีความจำเพาะมากกว่าเทคนิค PCR ที่ใช้ primer แค่ 2 สาย กลไกการสังเคราะห์เทคนิค LAMP จะใช้ดีเอ็นเอต้นแบบที่มีลักษณะคล้ายดัมเบล (dumbbell-shaped DNA structures) เป็นดีเอ็นเอตั้งต้นในการสังเคราะห์ซึ่งลักษณะดังกล่าวเป็นการทำงานร่วมกันระหว่างเอนไซม์ Bst. polymerase และ primer ที่มีลักษณะเฉพาะตัว นอกจากนี้ผลผลิตของเทคนิค LAMP ที่นำไปทำอะกาโรสเจลอิเล็กโตรโฟรีซิส จะพบหลายแถบ เป็นแถบขั้นบันได เนื่องจากว่าผลิตภัณฑ์ของเทคนิค LAMP มีหลากหลายขนาดแตกต่างกัน

การวิเคราะห์ผลการเพิ่มปริมาณสารพันธุกรรม โดยเทคนิค LAMP สามารถดูผลของการตรวจวัดได้ด้วยตาเปล่า ซึ่งเกิดจากปฏิกิริยาของแมกนีเซียม ไพโรฟอสเฟต (magnesium pyrophosphate) ที่รวมกับฟอสเฟตไอออน (pyrophosphate ion) จาก dNTPs กับแมกนีเซียมไอออน (magnesium ion) จากบัฟเฟอร์ของเอนไซม์ Bst. DNA polymerase โดยจะสังเกตุได้จากความขุ่นที่เกิดขึ้น นอกจากนี้ยังสามารถดูผลการเพิ่มปริมาณสารพันธุกรรมโดยใช้สารฟลูออเรสเซนต์ ทำให้เกิดการเรืองแสงในหลอดทดลองที่มีการเพิ่มปริมาณดีเอ็นเอได้อีกด้วย

 

การประยุกต์ใช้งานของเทคนิค LAMP

เนื่องจากคุณสมบัติของเทคนิคที่ง่าย ใช้เวลาน้อย ทำให้เทคนิคนี้ถูกนำไปใช้งานในด้านต่างๆ เช่นใช้ในการตรวจหายีนของเชื้อเพื่อช่วยในการวินิจฉัยโรค งานทางด้านตรวจจับเชื้อไวรัสต่างๆ ที่ก่อโรคในสัตว์ และการตรวจพืชดัดแปลงพันธุกรรม โดยออกแบบจัดทำชุดตรวจสอบภาคสนาม และห้องปฏิบัติการขนาดเล็ก เพื่อเฝ้าระวังพืชดัดแปลงพันธุกรรม ตัวอย่างงานวิจัยที่มีการใช้เทคนิค LAMP ได้แก่

  1. การตรวจสอบพืชดัดแปรพันธุกรรม ด้วยเทคนิค Loop-mediated Isothermal Amplification (LAMP)
  2. การศึกษาพัฒนาเทคนิค LAMP เพื่อการวินิจฉัยโรคไข้ง่วงหลับที่เกิดจากเชื้อโปรโตซัว Trypanosoma ทั้งในมนุษย์ และสัตว์
  3. การใช้เทคนิค LAMP ในการเพิ่มปริมาณสารพันธุกรรมเชื้อรา Pneumocystis pneumonia เพื่อการตรวจวินิจฉัยโรคปอดอักเสบ
  4. การทดสอบในเชื้อ Salmonella ในน้ำนมดิบ ซึ่งทำให้เกิดโรคทางเดินอาหาร
  5. การเพิ่มปริมาณสารพันธุกรรมของ เชื้อรา ไวรัส และ ปรสิต เพื่อนาไปใช้ประโยชน์ในทางการแพทย์ และอุตสาหกรรม
  6. การเพิ่มปริมาณสารพันธุกรรมเพื่อการตรวจระบุเพศของมนุษย์จากเนื้อเยื่อโพรงประสาทฟัน
  7. การใช้เทคนิค LAMP เพิ่มปริมาณสารพันธุกรรมของเชื้อมาลาเรียเพื่อการวินิจฉัยโรค
  8. การใช้เทคนิค LAMP ในการเพิ่มปริมาณสารพันธุกรรมของมนุษย์เพื่อการระบุความเป็นมนุษย์แยกจากสัตว์อื่น โดยทำใน ยีนไซโตโครมบี (cytochrom b)
  9. การใช้เทคนิค Loop-mediated Isothermal Amplification (LAMP) สำหรับตรวจเชื้อวัณโรค

 

ข้อดีของเทคนิค LAMP

มีประสิทธิภาพในการเพิ่มขยายยีนได้สูง ภายใต้สภาวะเดียวที่อุณหภูมิประมาณ 60-65 ํC มีความไวสูงในการตรวจจับ DNA สามารถตรวจจับ DNA จำนวนน้อยๆ ได้ถึง 6 copies ในการตรวจหาเชื้อไวรัส เทคนิค LAMP มีความไวมากกว่าเทคนิค PCR ประมาณ 10-100 เท่า และมีความจำเพาะสูงเพราะต้องใช้ specific sites ถึง 6 ตำแหน่ง โดยใช้ primers ถึง 4 เส้น ดังนั้นจะช่วยลด background จากการเพิ่มขยายยีนที่ไม่จำเพาะได้ เป็นเทคนิคที่ง่ายและใช้เครื่องมือน้อย เช่น อ่างน้ำควบคุมอุณหภูมิ ในส่วนการวัดผลสามารถดูได้ด้วยตาเปล่า

 

ข้อด้อยของเทคนิค LAMP

การออกแบบ primer จะค่อนข้างยุ่งยาก เพราะต้องให้จำเพาะกับยีนเป้าหมายถึง 6 ตำแหน่งและใช้ primer ในปริมาณที่มากกว่าปกติโดยเฉพาะ primer FIP และ BIP

คำสำคัญ :
กลุ่มบทความ :
หมวดหมู่ :
แชร์ :
https://erp.mju.ac.th/acticleDetail.aspx?qid=1307
ความคิดเห็นทั้งหมด (0)
ไม่มีข้อมูลตามเงื่อนไขที่ท่านกำหนด
รายการบทความการแลกเปลี่ยนเรียนรู้หมวดหมู่ : กลุ่มงานช่วยวิชาการ
อบรม online -นงคราญ » มาตรฐานความปลอดภัยห้องปฏิบัติการภาคเหนือตอนบน ประจำปี 2564 ภายใต้โครงการมหาวิทยาลัยแม่ข่ายด้านมาตรฐานความปลอดภัยห้องปฏิบัติการ : มหาวิทยาลัยเชียงใหม่ และการเตรียมความพร้อมของห้องปฏิบัติการเพื่อเข้าสู่การตรวจประเมินและรองรับห้องปฏิบัติการปลอดภัยเพื่อการยอมรับร่วม (peer evaluation)
การพัฒนาความปลอดภัยในห้องปฏิบัติการ หน่วยงาน/องค์กร ต้องมีการกระตุ้นในทุกระดับทั้งระดับองค์กร มหาวิทยาลัย หน่วยงาน คณะ/ภาควิชาและห้องปฏิบัติการ มีแผนยุทธศาสตร์เพื่อใช้ขับเคลื่อนและดำเนินงานด้านความ...
ESPReL Checklist  กลุ่มช่วยวิชาการ  การขอตรวจประเมินและรับรองห้องปฏิบัติการใน peer evaluation  มาตรฐานความปลอดภัยห้องปฏิบัติการ  อบรมonline     กลุ่มงานตามสมรรถนะบุคลากร   กลุ่มงานช่วยวิชาการ
ผู้เขียน นงคราญ พงศ์ตระกุล  วันที่เขียน 21/12/2564 12:37:47  แก้ไขล่าสุดเมื่อ 29/11/2565 11:10:19   เปิดอ่าน 1226  ครั้ง | แสดงความคิดเห็น 0  ครั้ง