การเตรียมตัวอย่างโปรตีน และการตรวจสอบทาง immunodetection
Western blot หรือเรียกอีกชื่อหนึ่งว่า Immunoblot เป็นเทคนิคที่ใช้ติดตามโปรตีนที่สนใจในสารตัวอย่าง หรือใช้ดูการแสดงออกในระดับโปรตีน โดยใช้หลักการของgel electrophoresis ใช้แยกได้ทั้ง native protein และ denatured protein และโปรตีนนั้นจะถูกย้ายจากแผ่นเจลไปยังแผ่นเมมเบรน ที่นิยมใช้ ได้แก่ nitrocellulose membrane และ polyvinylidene fluoride (PVDF) จากนั้นทำการตรวจสอบโปรตีนที่ต้องการโดยใช้ specific antibody
ขั้นตอนของการทำ Western blot
- การเตรียมตัวอย่าง ในกรณีที่เป็น cell line เซลล์จะถูกย่อยโดย lysis buffer เพื่อทำลายเยื่อหุ้มเซลล์ เก็บส่วนที่เป็นโปรตีนทั้งหมด และทิ้งเศษเซลล์ที่เป็นตะกอน การสกัดโปรตีนนั้นจะต้องมีการเติมสาร protease inhibitor ด้วยเป็นการป้องกันโปรตีนถูกย่อยสลายด้วยเอนไซม์ protease ที่มีอยู่ในเซลล์
- การแยกโปรตีน ออกตามขนาดภายใต้สนามไฟฟ้าที่มี Acrylamide gel เป็นตัวกลาง โดยโปรตีนจะถูกแยกเป็นตามขนาดน้ำหนักโมเลกุล ซึ่งจะเห็นเป็นแถบอย่างชัดเจนบนแผ่นเจล Acrylamide gel จะประกอบด้วย 2 ส่วน คือ stacking gel และ separating gel โดยส่วน stacking gel จะเป็นส่วนของเจลชั้นบนสุด มีความละเอียดของเจลต่ำ เพื่อทำให้โปรตีนทั้งหมดมารวมอยู่ ที่จุดเดียวกัน และจะได้เริ่มต้นจากจุดเดียวกัน ส่วน separating gel จะเป็นเจลที่อยู่ต่อจาก stacking gel เป็นบริเวณที่ใช้แยกโปรตีนที่มีขนาดแตกต่างกันออกไป
- การย้ายโปรตีนจากเจลสู่แผ่นเมมเบรน (protein transfer) เป็นการย้ายโปรตีนผ่านการแยกด้วยเจลอิเลคโตรฟอเรซีส แล้วย้ายสู่เมมเบรนที่มีประจุบวกเช่น nitrocellulose หรือ polyvinylidene fluoride(PVDF)
- นำแผ่นเมมเบรนไปทำการ Blocking เพื่อป้องกันการเกิด non-specific หรือป้องกันไม่ให้โปรตีนอื่นๆเข้ามาจับกับแผ่นเมมเบรน โดยจะทำการ blocking ด้วย bovine serum albumin (BSA) หรือ non-fat dry milk ซึ่งโปรตีนเหล่านี้จะจับบนที่ว่างของแผ่นเมมเบรน ยกเว้นบริเวณที่มีโปรตีนจับอยู่แล้ว ดังนั้นการทำ blocking จึงมีความสำคัญ เพราะจะช่วยลดการเกิด false positives ด้วย
- การติดตามผล (detection) ในขั้นตอนการติดตามผลนั้นจะมีการ probe เมมเบรนเพื่อหาโปรตีนที่สนใจด้วยแอนติบอดีซึ่งอาจมีการลิงค์ด้วยเอนไซม์ หรือสารเรืองแสงอื่น และเมื่อทำปริกิริยากับสารตั้งต้นจะทำให้มีสีเกิดขึ้นหรือมีการเปล่งแสงออกมา
- การวิเคราะห์ผล (Analysis) หลังจากทำการบ่มแผ่นเมมเบรนด้วยแอนติบอดีที่มีความจำเพาะแล้ว จากนั้นจะเป็นวิธีการติดตามว่าแอนติบอดีไปเกาะกับโปรตีนเป้าหมายที่ตำแหน่งใด ซึ่งการติดต่อวิเคราะห์ผลก็ขึ้นอยู่กับว่าแอนติบอดีที่ใช้ ติดฉลากด้วยสารอะไร แบ่งได้เป็น
- Colorimetric detection เป็นการติดตามผลโดยดูการเกิดสี ที่เกิดจากเอนไซม์ย่อยสารตั้งต้นแล้วเกิดขึ้นบนแผ่นเมมเบรน
- Chemiluminescent detection เป็นการติดตามผลโดยการเรืองแสง ซึ่ง substrate ที่ใช้เมื่อถูกย่อยด้วยเอนไซม์แล้วทำให้เกิดการเรืองแสงขึ้นมา อาจต้องติดตามด้วย photographic filter หรือกล้อง CCD เพื่อจับภาพของเมมเบรน
- Radioactive detection การติดตามเป็นวิธีนี้ไม่ต้องใช้ substrate เพราะแอนติบอดี ถูกติดฉลากด้วยสารรังสีซึ่งจะเกิดการเปล่งแสงออกมา ต้องติดตามผลด้วยการประกบกับฟิล์มเอกซเรย์
- Fluorescent detection การวิเคราะห์และติดตามผลแบบนี้แอนติบอดีจะถูกติดฉลากมาด้วยสารเรืองแสง (fluorescent) ซึ่งจะต้องมีการกระตุ้น (excitation) ในช่วงความยาวคลื่นที่เหมาะสม และมีการ ปล่อยแสง (emission) ในช่วงความยาวคลื่นที่เหมาะสมเช่นเดียวกัน ดังนั้นจะต้องดูผลโดยการใช้กล้อง photosensor เช่นกล้อง CCD ที่มี filter ในช่วงความยาวคลื่นตรงกันกับสารเรืองแสงเหล่านั้นในการจับภาพ