การเตรียมตัวอย่างโปรตีน และการตรวจสอบทาง immunodetection
วันที่เขียน 6/10/2563 14:42:10     แก้ไขล่าสุดเมื่อ 30/10/2563 14:42:03
เปิดอ่าน: 112 ครั้ง

การเตรียมตัวอย่างโปรตีน และการตรวจสอบทาง immunodetection Western blot หรือเรียกอีกชื่อหนึ่งว่า Immunoblot เป็นเทคนิคที่ใช้ติดตามโปรตีนที่สนใจในสารตัวอย่าง หรือใช้ดูการแสดงออกในระดับโปรตีน โดยใช้หลักการของgel electrophoresis ใช้แยกได้ทั้ง native protein และ denatured protein และโปรตีนนั้นจะถูกย้ายจากแผ่นเจลไปยังแผ่นเมมเบรน ที่นิยมใช้ ได้แก่ nitrocellulose membrane และ polyvinylidene fluoride (PVDF) จากนั้นทำการตรวจสอบโปรตีนที่ต้องการโดยใช้ specific antibody

การเตรียมตัวอย่างโปรตีน และการตรวจสอบทาง immunodetection

 

Western blot หรือเรียกอีกชื่อหนึ่งว่า Immunoblot เป็นเทคนิคที่ใช้ติดตามโปรตีนที่สนใจในสารตัวอย่าง หรือใช้ดูการแสดงออกในระดับโปรตีน โดยใช้หลักการของgel electrophoresis ใช้แยกได้ทั้ง native protein และ denatured protein และโปรตีนนั้นจะถูกย้ายจากแผ่นเจลไปยังแผ่นเมมเบรน ที่นิยมใช้ ได้แก่ nitrocellulose membrane และ polyvinylidene fluoride (PVDF) จากนั้นทำการตรวจสอบโปรตีนที่ต้องการโดยใช้ specific antibody

ขั้นตอนของการทำ Western blot

  1. การเตรียมตัวอย่าง ในกรณีที่เป็น cell line เซลล์จะถูกย่อยโดย lysis buffer เพื่อทำลายเยื่อหุ้มเซลล์ เก็บส่วนที่เป็นโปรตีนทั้งหมด และทิ้งเศษเซลล์ที่เป็นตะกอน การสกัดโปรตีนนั้นจะต้องมีการเติมสาร protease inhibitor ด้วยเป็นการป้องกันโปรตีนถูกย่อยสลายด้วยเอนไซม์ protease ที่มีอยู่ในเซลล์
  2. การแยกโปรตีน ออกตามขนาดภายใต้สนามไฟฟ้าที่มี Acrylamide gel เป็นตัวกลาง โดยโปรตีนจะถูกแยกเป็นตามขนาดน้ำหนักโมเลกุล ซึ่งจะเห็นเป็นแถบอย่างชัดเจนบนแผ่นเจล Acrylamide gel จะประกอบด้วย 2 ส่วน คือ stacking gel และ separating gel  โดยส่วน stacking gel จะเป็นส่วนของเจลชั้นบนสุด มีความละเอียดของเจลต่ำ เพื่อทำให้โปรตีนทั้งหมดมารวมอยู่ ที่จุดเดียวกัน และจะได้เริ่มต้นจากจุดเดียวกัน ส่วน separating gel จะเป็นเจลที่อยู่ต่อจาก stacking gel เป็นบริเวณที่ใช้แยกโปรตีนที่มีขนาดแตกต่างกันออกไป
  3. การย้ายโปรตีนจากเจลสู่แผ่นเมมเบรน (protein transfer) เป็นการย้ายโปรตีนผ่านการแยกด้วยเจลอิเลคโตรฟอเรซีส แล้วย้ายสู่เมมเบรนที่มีประจุบวกเช่น nitrocellulose หรือ polyvinylidene fluoride(PVDF)
  4. นำแผ่นเมมเบรนไปทำการ Blocking เพื่อป้องกันการเกิด non-specific หรือป้องกันไม่ให้โปรตีนอื่นๆเข้ามาจับกับแผ่นเมมเบรน โดยจะทำการ blocking ด้วย bovine serum albumin (BSA) หรือ non-fat dry milk  ซึ่งโปรตีนเหล่านี้จะจับบนที่ว่างของแผ่นเมมเบรน ยกเว้นบริเวณที่มีโปรตีนจับอยู่แล้ว ดังนั้นการทำ blocking จึงมีความสำคัญ เพราะจะช่วยลดการเกิด false positives ด้วย
  5. การติดตามผล (detection) ในขั้นตอนการติดตามผลนั้นจะมีการ probe เมมเบรนเพื่อหาโปรตีนที่สนใจด้วยแอนติบอดีซึ่งอาจมีการลิงค์ด้วยเอนไซม์ หรือสารเรืองแสงอื่น และเมื่อทำปริกิริยากับสารตั้งต้นจะทำให้มีสีเกิดขึ้นหรือมีการเปล่งแสงออกมา
  6. การวิเคราะห์ผล (Analysis) หลังจากทำการบ่มแผ่นเมมเบรนด้วยแอนติบอดีที่มีความจำเพาะแล้ว จากนั้นจะเป็นวิธีการติดตามว่าแอนติบอดีไปเกาะกับโปรตีนเป้าหมายที่ตำแหน่งใด ซึ่งการติดต่อวิเคราะห์ผลก็ขึ้นอยู่กับว่าแอนติบอดีที่ใช้ ติดฉลากด้วยสารอะไร แบ่งได้เป็น

- Colorimetric detection เป็นการติดตามผลโดยดูการเกิดสี ที่เกิดจากเอนไซม์ย่อยสารตั้งต้นแล้วเกิดขึ้นบนแผ่นเมมเบรน

- Chemiluminescent detection เป็นการติดตามผลโดยการเรืองแสง ซึ่ง substrate ที่ใช้เมื่อถูกย่อยด้วยเอนไซม์แล้วทำให้เกิดการเรืองแสงขึ้นมา อาจต้องติดตามด้วย photographic filter หรือกล้อง CCD เพื่อจับภาพของเมมเบรน

- Radioactive detection การติดตามเป็นวิธีนี้ไม่ต้องใช้ substrate เพราะแอนติบอดี ถูกติดฉลากด้วยสารรังสีซึ่งจะเกิดการเปล่งแสงออกมา ต้องติดตามผลด้วยการประกบกับฟิล์มเอกซเรย์

- Fluorescent detection การวิเคราะห์และติดตามผลแบบนี้แอนติบอดีจะถูกติดฉลากมาด้วยสารเรืองแสง (fluorescent) ซึ่งจะต้องมีการกระตุ้น (excitation) ในช่วงความยาวคลื่นที่เหมาะสม และมีการ ปล่อยแสง (emission) ในช่วงความยาวคลื่นที่เหมาะสมเช่นเดียวกัน ดังนั้นจะต้องดูผลโดยการใช้กล้อง photosensor เช่นกล้อง CCD ที่มี filter ในช่วงความยาวคลื่นตรงกันกับสารเรืองแสงเหล่านั้นในการจับภาพ 

คำสำคัญ :
กลุ่มบทความ :
หมวดหมู่ :
แชร์ :
https://erp.mju.ac.th/acticleDetail.aspx?qid=1129
ความคิดเห็นทั้งหมด (0)
ไม่มีข้อมูลตามเงื่อนไขที่ท่านกำหนด
รายการบทความการแลกเปลี่ยนเรียนรู้หมวดหมู่ : กลุ่มงานช่วยวิชาการ
สรุปรายงานจากการอบรม » ความหลากหลายของสายพันธุ์กัญชา
กัญชาเป้นพืชที่มีทั้งประโยชน์และโทษ ประโยชน์ที่มีการศึกษาการอย่างแพร่หลายคือมีสาร CBD และ THC ที่ใช้นำมารักษาโรค โดยสัดส่วนของปริมาณทั้งสองมีความจำเพาะในแต่ละโรค ดังนั้นจึงต้องศึกษาถึงสายพันธุ์ของก...
กัญชา สายพันธุ์กัญชา     กลุ่มงานตามสมรรถนะบุคลากร   กลุ่มงานช่วยวิชาการ
ผู้เขียน วริศรา สุวรรณ  วันที่เขียน 7/10/2562 9:47:03  แก้ไขล่าสุดเมื่อ 30/10/2563 13:19:41   เปิดอ่าน 9113  ครั้ง | แสดงความคิดเห็น 0  ครั้ง
การเตรียมเอนไซม์อาหารสัตว์จากก้อนเพาะเห็ดเก่า เพื่อปรับปรุงประสิทธิภาพการใช้ประโยชน์ได้ของอาหารสัตว์เศรษฐกิจในท้องถิ่น » การเตรียมเอนไซม์อาหารสัตว์จากก้อนเพาะเห็ดเก่า เพื่อปรับปรุงประสิทธิภาพการใช้ประโยชน์ได้ของอาหารสัตว์เศรษฐกิจในท้องถิ่น
ก้อนเห็ดหมดอายุเป็นแหล่งของเอนไซม์ กลุ่มย่อยโพลิแซคคาไรด์หลายชนิดที่นำมาใช้เป็นเอนไซม์เสริมในอาหารสัตว์ได้ และจากผลวิเคราะห์ค่ากิจกรรมเอนไซม์ย่อยโพลีแซคคาไรด์ในก้อนเห็ดหมดอายุ 4 ชนิด ได้แก่ เห็ดยาน...
ก้อนเห็ดหมดอายุ เอนไซม์อาหารสัตว์ การใช้ประโยชน์ได้ของอาหารสัตว์     กลุ่มงานตามสมรรถนะบุคลากร   กลุ่มงานช่วยวิชาการ
ผู้เขียน ภานรินทร์ ปรีชาวัฒนากร  วันที่เขียน 13/9/2562 14:30:11  แก้ไขล่าสุดเมื่อ 29/10/2563 22:46:14   เปิดอ่าน 670  ครั้ง | แสดงความคิดเห็น 0  ครั้ง
มหัศจรรย์กระเทียมดำ » มหัศจรรย์กระเทียมดำ
นักวิจัยได้ศึกษาพบว่า ในระหว่างการหมักบ่มกระเทียมสด สาระสำคัญที่ไม่คงตัว และมีกลิ่นฉุน จะถูกเปลี่ยนเป็นสารที่คงตัว และไม่มีกลิ่นฉุน ซึ่งได้แก่ • S-allycysteine (SAC) เป็นสารประกอบกำมะถันที่ละลายใน...
กระเทียมดำ     กลุ่มงานตามสมรรถนะบุคลากร   กลุ่มงานช่วยวิชาการ
ผู้เขียน ภานรินทร์ ปรีชาวัฒนากร  วันที่เขียน 10/9/2562 15:59:37  แก้ไขล่าสุดเมื่อ 30/10/2563 14:27:08   เปิดอ่าน 14615  ครั้ง | แสดงความคิดเห็น 0  ครั้ง