-

เทคนิคการแยกสารด้วยโครมาโทกราฟี

โครมาโทกราฟี (chromatography) เป็นเทคนิคในห้องปฏิบัติการทางเคมีเพื่อใช้ในการแยกสารผสม โดยให้องค์ประกอบของสารที่ถูกแยกกระจายอยู่ระหว่าง 2 เฟส (Phase) คือ เฟสคงที่ (Stationary Phase) และเฟสเคลื่อนที่ (Mobile Phase) โดยอาศัยหลักการของการละลายในตัวทำละลาย และการถูกดูดซับโดยตัวดูดซับของสารผสมนั้น ๆ โดยสารผสมนั้น ๆ จะมีความสามารถในการละลายและดูดซับที่แตกต่างกัน จึงทำให้สารเคลื่อนที่ได้ไม่เท่ากัน นักวิทยาศาสตร์จึงใช้เทคนิคนี้ในการแยกสารต่าง ๆ ออกจากกันเพื่อนำไปวิเคราะห์และพัฒนาต่อทั้งในเชิงปริมาณและคุณภาพ เทคนิคโครมาโทกราฟีถูกพัฒนาให้ตรงกับความต้องการในการใช้งานได้ในอีกหลายประเภท โดยแบ่งตามชนิดของเฟสคงที่ และเฟสเคลื่อนที่หรือคุณสมบัติของสาร เช่น แก๊สโครมาโทกราฟี (Gas Chromatography) และ โครมาโทกราฟีของเหลวสมรรถนะสูง (High Performance Liquid Chromatography) เป็นต้น

โครมาโทกราฟีแบบของเหลวสามารถจำแนกประเภทตามชนิดของแรงที่ทำให้เกิดปฏิกิริยาระหว่างโมเลกุลของสารกับส่วนอยู่กับที่ได้ดังนี้

1. โครมาโทกราฟีแบบแยกตามความจำเพาะ (Affinity chromatography) เป็นเทนิคที่ใช้ในการแยกสาร โดยอาศัยความจำเพาะทางชีวภาพระหว่างโมเลกุลของสารที่ต้องการแยกกับตัวเชื่อมโยงที่เรียกว่าลิแกนด์ เนื่องจากในธรรมชาติสารบางชนิดมีการจับกันอย่างจำเพาะ เช่น การจับกันระหว่างแอนติบอดี้กับแอนติเจน เอนไซม์ กับซับสเตรท หรือเอนไซม์กับโคแฟกเตอร์เป็นต้น จึงใช้คุณสมบัตินี้ในการแยกสารชีวโมเลกุลที่ต้องการ
2. โครมาโทกราฟฟีแบบแยกขนาด (Size exclusion chromatography) เกี่ยวข้องกับการที่สารจะถูกเลือกให้แพร่ผ่านรูพรุนของของ packings ที่มีลักษณะเป็น network 3 มิติ และอาจเป็นพวก gel หรือของแข็งที่มีรูพรุนซึ่งอาจเป้นสารประกอบอินทรีย์ การที่สารจะถูกยึดเหนี่ยวในคลอลัมน์นานหรือไม่นั้นขึ้นอยู่กับขนาดของโมเลกุลเมื่อเทียบกับขนาดรูของอนุภาคที่ถูกบรรจุอยู่ในคลอลัมน์ โมเลกุลเล็กสามารถที่แพร่ผ่านเข้าไปในรูที่เล็ก โมเลกุลที่มีขนาดกึ่งกลางไม่ใหญ่มากนักจะแพร่ผ่านได้เฉพาะบางส่วนของรูที่อยู่ในอนุภาคเท่านั้น และจะถูกกีดกันจากรูที่เล็กมาก ๆ สำหรับโมเลกุลที่ใหญ่จะถูกกีดกันออกไป และไม่สามารถแพร่เข้าไปในรูได้ ดังนั้น โมเลกุลที่มีขนาดใหญ่จะเดินทางเร็วมาก และจะออกมาจากคลอลัมน์เป็นพพวกแรก เหมาะสำหรับแยกสารที่มีโมเลกุลสูง เช่น พอลิเมอร์ ไบโอพอลิเมอร์ ออกจากโมเลกุลเล็กๆ
3. โครมาโทกราฟฟีแบบแลกเปลี่ยนไออน (Ion exchange chromatography) ขึ้นอยู่กับสัมพรรคภาพของไอออนในสารละลายกับไอออนที่มีประจุตรงกันข้ามซึ่งอยู่ที่ผิวของเฟสอยู่กับที่ ion exchanger ประกอบไปด้วยของแข็งที่มีรูพรุนซึ่งปรกติ แล้วจะเป็นพวกเรซิน ที่มี ion group ต่ออยู่ด้วยพันธะทางเคมีเฟสเคลื่อนที่ส่วนใหญ่จะเป็นสารละลายบัฟฟเฟอร์ซึ่งประกอบไปด้วย counter ion ที่มีประจุตรงข้ามกับ group ที่อยู่บนผิวของอนุภาคที่บรรจุอยู่ นั่นก็คือไอออนในเฟสเคลื่อนที่จะมีประจุเหมือนกับไอออนที่ต้องการแยกซึ่งไอออนดังกล่าวนี้จะรวมกับ group ที่อยู่บนผิวของเรซินในลักษณะเป็น ion pair เพื่อทำให้ประจุทั้งหมดอยู่ในสภาวะสมดุล การแข่งขันกันระหว่างไอออนในสารละลายกับ counter ion เพื่อเข้าครอบครองตำแหน่งที่มีประจุบนผิวของเรซินจะมีผลทำให้เกิดการยึดเกาะขึ้น นิยมใช้ในแยกไอออนของโลหะ แยกโปรตีน และกรดอะมิโนเป็นต้น
4. โครมาโทกราฟฟีแบบดูดซับ (Adsorption chromatography) อาศัยอันตรกิริยาที่ต่างกันระหว่างสารกับตำแหน่งซึ่ง ฟแรอำ บนผิวของตัวดูดซับที่ใช้เป็นเฟสคงที่ ตัวดูดซับจะถูกบรรจุในคลอลัมน์ หรือเคลือบบนเพลท หรือซึมเข้าไปในตัวกระดาษที่มีรูพรุน ตัวดูดซับจะเป็นของแข็งที่มีรุพรุนและมีพื้นผิวมาก เช่น ซิลิกา อะลูมินา หรือผงถ่าน ซึ่งตำแหน่งที่ active บนซิลิกาเจลสามารถเกิดอันตรกิริยาปฏิกิริยากับฟังชันนัลกรุ๊ปที่มีขั้ว ส่วนสารไม่มีขั้วที่อยู่ในโมเลกุล จะมีอิทธิพลน้อยมาก จึงเหมาะกับการแยกสารประกออบมีขั้วเช้น การแยกแอลกอฮอล์ ออกจาก อะโรมาติกไฮโดรคาร์บอน

การแยกสารแบบแฟลชโครมาโตกราฟี และ Prep HPLC 

เทคนิคทั้งสองเป็นการแยกสารแบบโครมาโทกราฟฟีแบบดูดซับ เป็นเทคนิคที่นิยมใช้เพื่อวัตถุประสงค์ในการแยกสาร โดยแฟลชโครมาโทกราฟีจะเป็นการแยกสารให้มีความบริสุทธิ์ และต้องการแยกสารในปริมาณมากมี ส่วนการแยกแบบ Prep HPLC เป็นการแยกสารให้มีความบริสุทธิ์และความละเอียด โดยในการแยกจะใช้สารในปริมาณที่น้อย หากใช้เทคนิคทั้งสองร่วมกันจะใช้การแยกแบบแฟลชโครมาโทกราฟีก่อนเพื่อ และตามด้วยการใช้แบบ Prep HPLC เพื่อให้ได้ความบริสุทธิ์ขั้นสุดท้าย ดังนั้นเทคนิคโครมาโทกราฟีทั้งสองจึงแตกต่างกันตรงส่วนของวัสดุที่ใช้สำหรับทำเฟสคงที่ (ขนาดอนุภาคต่างกัน) ซึ่งขนาดของตลับหรือคอลัมน์ (เส้นผ่านศูนย์กลางภายใน (Internal Diameter - ID) และความยาว) รวมถึงอัตราการไหลในเฟสเคลื่อนที่ดังที่แสดงในตาราง

ตารางความแตกต่างระหว่างแฟลชโครมาโตกราฟีและ Prep HPLC 

ระบบการแยกสารด้วยวิธีโครมาโทกราฟีแบบยิ่งยวด Sepiatec SFC

 เป็นเทคนิคการแยกสารโดยการใช้คาร์บอนไดออกไซด์แทนตัวทำละลายอินทรีย์ การแยกสารแบบนี้ สามารถลดปริมาณการใช้เฟสเคลื่อนที่ซึ่งมีราคาแพง เป็นอันตราย และมีผลเสียต่อสิ่งแวดล้อมน้อยลงมากในขณะที่ยังคงใช้เวลาทำงานที่สั้นกว่าและมีประสิทธิภาพสูงขึ้นในการแยกสารสำหรับสารประกอบได้หลายประเภท  โครมาโทกราฟีประเภทนี้มีระยะเวลาทำงานสั้นลงเนื่องจากของไหลวิกฤตยิ่งยวด ซึ่งนำมาใช้เป็นเฟสเคลื่อนที่นั้นมีความหนืดต่ำ การแยกสารสามารถบรรลุสู่ระดับที่มีประสิทธิภาพสูงอย่างง่ายดาย ทำให้สามารถมีความจุการโหลดสารที่เพิ่มขึ้น และรอบเวลาการฉีดสารตัวอย่างที่รวดเร็ว ซึ่งทำให้กระบวนการทำงานเร็วยิ่งขึ้นกว่าเดิม นอกจากนี้ยังสามารถประหยัดเวลาได้เนื่องจากมีการกำจัดและการคืนกลับของตัวทำละลายที่เร็วขึ้น

ที่มาข้อมูล
1. เทคนิคโครมาโทกราฟี. 2024. [ออนไลน์], แหล่งที่มา: https://www.nsm.or.th/nsm/th/node/5742  [14 พฤศจิกายน 2567]

2. วิธีแยกสารแบบ Flash และ Prep. 2024. [ออนไลน์], แหล่งที่มา: https://www.buchi.com/th/knowledge/technologies/chromatography [14 พฤศจิกายน 2567]
3. วิธีแยกสารแบบ Flash และ Prep. 2024. [ออนไลน์], แหล่งที่มา: https://www.buchi.com/th/products/instruments/pure-chromatography-systems [14 พฤศจิกายน 2567]
4. แม้น อมรสิทธิ์ และอมร เพชรสม. 2535. หลักการและเทคนิควิเคราะห์เชิงเครื่องมือ. พิมพ์ครั้งที่ 1. กรุงเทพฯ. ชวนพิมพ์.